In [1]:
######## snakemake preamble start (automatically inserted, do not edit) ########
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Sequencing-based neutralization assays of 2023-2024 human serum samples versus H3N2 influenza libraries\n\nThe numerical data and computer code are at [https://github.com/jbloomlab/flu_seqneut_H3N2_2023-2024](https://github.com/jbloomlab/flu_seqneut_H3N2_2023-2024)\n\x94\x8c\x0fviral_libraries\x94}\x94(\x8c\x0cH3N2_library\x94\x8c)data/viral_libraries/2023_H3N2_Kikawa.csv\x94\x8c\x0cH1N1_library\x94\x8c-data/viral_libraries/pdmH1N1_lib2023_loes.csv\x94u\x8c\x17viral_strain_plot_order\x94\x8c+data/H3N2library_2023-2024_strain_order.csv\x94\x8c\x12neut_standard_sets\x94}\x94\x8c\x08loes2023\x94\x8c3data/neut_standard_sets/loes2023_neut_standards.csv\x94s\x8c\x1eillumina_barcode_parser_params\x94}\x94(\x8c\x08upstream\x94\x8c\x1cCCTACAATGTCGGATTTGTATTTAATAG\x94\x8c\ndownstream\x94\x8c\x00\x94\x8c\x04minq\x94K\x14\x8c\x11upstream_mismatch\x94K\x04\x8c\x0ebc_orientation\x94\x8c\x02R2\x94u\x8c#default_process_plate_qc_thresholds\x94}\x94(\x8c\x1bavg_barcode_counts_per_well\x94M\xf4\x01\x8c\x1fmin_neut_standard_frac_per_well\x94G?tz\xe1G\xae\x14{\x8c"no_serum_per_viral_barcode_filters\x94}\x94(\x8c\x08min_frac\x94G?\x1a6\xe2\xeb\x1cC-\x8c\x0fmax_fold_change\x94K\x04\x8c\tmax_wells\x94K\x02u\x8c!per_neut_standard_barcode_filters\x94}\x94(\x8c\x08min_frac\x94G?tz\xe1G\xae\x14{\x8c\x0fmax_fold_change\x94K\x04\x8c\tmax_wells\x94K\x02u\x8c 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llaneous_plates/2024-02-07_H1N1_sampleData_rePool_MOItest.csv\x94u\x8c\x1f240328_repool_H3N2_variableCell\x94}\x94(\x8c\x04date\x94j\xf3\x02\x00\x00C\x04\x07\xe8\x03\x1c\x94\x85\x94R\x94\x8c\rviral_library\x94\x8c\x0cH3N2_library\x94\x8c\x11neut_standard_set\x94\x8c\x08loes2023\x94\x8c\x0bsamples_csv\x94\x8cBdata/miscellaneous_plates/2024-03-28_H3N2_MOItest_variableCell.csv\x94u\x8c\x1c240924_repool_H3N2_balancing\x94}\x94(\x8c\x04date\x94j\xf3\x02\x00\x00C\x04\x07\xe8\t\x18\x94\x85\x94R\x94\x8c\rviral_library\x94\x8c\x0cH3N2_library\x94\x8c\x11neut_standard_set\x94\x8c\x08loes2023\x94\x8c\x0bsamples_csv\x94\x8c>data/miscellaneous_plates/2024-09-24_repool_H3N2_balancing.csv\x94\x8c\x1eillumina_barcode_parser_params\x94}\x94(\x8c\tupstream2\x94\x8c\x06GCTACA\x94\x8c\x12upstream2_mismatch\x94K\x01uuuu\x8c\x04rule\x94\x8c\x12aggregate_qc_drops\x94\x8c\x0fbench_iteration\x94N\x8c\tscriptdir\x94\x8ck/fh/fast/bloom_j/computational_notebooks/ckikawa/2024/flu_seqneut_H3N2_2023-2024/seqneut-pipeline/notebooks\x94ub.');del script;from snakemake.logging import logger;from snakemake.script import snakemake; logger.printshellcmds = False;import os; os.chdir(r'/fh/fast/bloom_j/computational_notebooks/ckikawa/2024/flu_seqneut_H3N2_2023-2024');
######## snakemake preamble end #########

Aggregate and analyze the drops from QC-ing the plates and sera¶

In [2]:
import altair as alt

import pandas as pd

from ruamel.yaml import YAML

yaml = YAML(typ="rt")

_ = alt.data_transformers.disable_max_rows()

Get variables from snakemake:

In [3]:
input_plate_qc_drops = snakemake.input.plate_qc_drops
input_groups_sera_qc_drops = snakemake.input.groups_sera_qc_drops
output_plate_qc_drops = snakemake.output.plate_qc_drops
output_groups_sera_qc_drops = snakemake.output.groups_sera_qc_drops
plates = snakemake.params.plates
groups_sera = snakemake.params.groups_sera

Analyze plate QC drops¶

Read QC drops for individual plates into a merged dictionary, write it to YAML, and also convert to a DataFrame. If you really want to look into the details of what is being dropped, you will want to look at that merged YAML file.

In [4]:
# read dictionary of QC drops
assert len(plates) == len(input_plate_qc_drops)
plate_qc_drops = {}
for plate, qc_drops_yaml in zip(plates, input_plate_qc_drops):
    with open(qc_drops_yaml) as f:
        plate_qc_drops[plate] = yaml.load(f)
assert len(plate_qc_drops) == len(input_plate_qc_drops)

print(f"Writing merged plate drops to {output_plate_qc_drops}")
with open(output_plate_qc_drops, "w") as f:
    yaml.dump(plate_qc_drops, stream=f)

# convert dictionary of QC drops into list of tuples
plate_qc_drop_tups = [
    (plate_key, droptype_key, drop_key, reason)
    for (plate_key, plate_val) in plate_qc_drops.items()
    for droptype_key, droptype_val in plate_val.items()
    for drop_key, reason in droptype_val.items()
]

# create data frame of QC drops
plate_qc_drops_df = pd.DataFrame(
    plate_qc_drop_tups,
    columns=["plate", "drop type", "drop", "reason"],
)

Writing merged plate drops to results/qc_drops/plate_qc_drops.yml
In [5]:
plate_qc_drop_counts = plate_qc_drops_df.groupby(
    ["plate", "drop type", "reason"], as_index=False
).aggregate(n_drops=pd.NamedAgg("drop", "nunique"))
assert plate_qc_drop_counts["n_drops"].sum() == len(plate_qc_drops_df)

Now plot the number of drops for each plate. You should be worried (maybe re-do or discard) any plates with a very large number of drops:

In [6]:
plate_selection = alt.selection_point(fields=["plate"], on="mouseover", empty=False)

plate_qc_drop_counts_chart = (
    alt.Chart(plate_qc_drop_counts)
    .add_params(plate_selection)
    .encode(
        alt.X(
            "n_drops",
            title="number of drops",
        ),
        alt.Y(
            "plate",
            sort=plates,
            title=None,
            axis=alt.Axis(labelFontStyle="bold", labelFontSize=11),
        ),
        alt.Column(
            "drop type",
            title=None,
            spacing=5,
            header=alt.Header(labelFontSize=12, labelFontStyle="bold", labelPadding=1),
        ),
        alt.Color(
            "reason",
            legend=alt.Legend(
                orient="top", columns=1, labelLimit=230, title=None, padding=1
            ),
        ),
        strokeWidth=alt.condition(plate_selection, alt.value(3), alt.value(0.5)),
        tooltip=plate_qc_drop_counts.columns.tolist(),
    )
    .mark_bar(height={"band": 0.8}, stroke="black")
    .properties(
        width=230,
        height=alt.Step(16),
        title=alt.TitleParams(
            "Number of QC drops when processing plates", anchor="middle", dy=-2
        ),
    )
    .configure_axis(grid=False)
    .resolve_scale(color="independent", x="independent")
)

plate_qc_drop_counts_chart
Out[6]:

Look for barcodes dropped especially often in plate QC¶

If a barcode is dropped especially often across plates, that could indicate something problematic with that barcode such that it should be removed altogether from the library analysis.

In [7]:
barcode_drops = (
    plate_qc_drops_df.query("`drop type`.str.startswith('barcode')")
    .assign(barcode=lambda x: x["drop"].str.split().str[0])
    .groupby(["drop type", "barcode"], as_index=False)
    .aggregate(
        plates_where_dropped=pd.NamedAgg("plate", "nunique"),
        total_drops=pd.NamedAgg("plate", "count"),
    )
)

barcode_selection = alt.selection_point(fields=["barcode"], on="mouseover", empty=False)

barcode_drops_chart = (
    alt.Chart(barcode_drops)
    .add_params(barcode_selection)
    .encode(
        alt.X(
            "total_drops",
            title="times barcode dropped",
        ),
        alt.Y(
            "barcode",
            sort=alt.SortField("total_drops", order="descending"),
            axis=alt.Axis(labelFontSize=9),
        ),
        alt.Column(
            "drop type",
            title=None,
            spacing=8,
            header=alt.Header(labelFontSize=12, labelFontStyle="bold", labelPadding=1),
        ),
        strokeWidth=alt.condition(barcode_selection, alt.value(3), alt.value(0.5)),
        tooltip=barcode_drops.columns.tolist(),
    )
    .mark_bar(height={"band": 0.8}, stroke="black")
    .properties(
        width=200,
        height=alt.Step(10),
        title=alt.TitleParams(
            "Number of QC drops when processing plates", anchor="middle", dy=-2
        ),
    )
    .configure_axis(grid=False)
    .resolve_scale(color="independent", x="independent", y="independent")
)

barcode_drops_chart
Out[7]:

Analyze the groups/sera QC¶

Analyze the QC performed on the groups/sera, which involves completely dropping titers for certain virus-sera pairs.

Read the QC for different groups/sera into a merged dictionary, write it to YAML, and also convert to a DataFrame. If you really want to look into the details of what is being dropped, you will want to look at that merged YAML file.

In [8]:
# read dictionary of QC drops
assert len(groups_sera) == len(input_groups_sera_qc_drops)
groups_sera_qc_drops = {}
for (group, serum), qc_drops_yaml in zip(groups_sera, input_groups_sera_qc_drops):
    if group not in groups_sera_qc_drops:
        groups_sera_qc_drops[group] = {}
    with open(qc_drops_yaml) as f:
        groups_sera_qc_drops[group][serum] = yaml.load(f)

print(f"Writing merged groups/sera drops to {output_groups_sera_qc_drops}")
with open(output_groups_sera_qc_drops, "w") as f:
    yaml.dump(groups_sera_qc_drops, stream=f)

# convert dictionary of QC drops into list of tuples
groups_sera_qc_drop_tups = [
    (group_key, serum_key, virus, reason)
    for (group_key, group_val) in groups_sera_qc_drops.items()
    for (serum_key, serum_val) in group_val.items()
    for virus, reason in serum_val.items()
]

# create data frame of QC drops
groups_sera_qc_drops_df = pd.DataFrame(
    groups_sera_qc_drop_tups,
    columns=["group", "serum", "virus", "reason"],
)

Writing merged groups/sera drops to results/qc_drops/groups_sera_qc_drops.yml

Plot the number of viruses dropped for each group/serum. If a group/serum has many missed viruses, then you will lack a lot of titers and so it may be worth reviewing the cause of the drops.

In [9]:
groups_sera_n_drops = groups_sera_qc_drops_df.groupby(
    ["group", "serum", "reason"], as_index=False
).aggregate(n_viruses=pd.NamedAgg("virus", "nunique"))
assert groups_sera_n_drops["n_viruses"].sum() == len(groups_sera_qc_drops_df)

groups_sera_n_drops_chart = (
    alt.Chart(groups_sera_n_drops)
    .encode(
        alt.X("n_viruses", title="number of viruses dropped"),
        alt.Y("serum"),
        alt.Row("group"),
        alt.Color("reason", title="reason dropped", legend=alt.Legend(labelLimit=350)),
        tooltip=groups_sera_n_drops.columns.tolist(),
    )
    .mark_bar(height={"band": 0.8})
    .properties(
        width=250,
        height=alt.Step(13),
        title="Number of viruses dropped at serum QC for each serum",
    )
    .configure_axis(grid=False)
    .resolve_scale(y="independent", x="independent")
)

groups_sera_n_drops_chart
Out[9]:

Plot the number of sera for which each virus is dropped during serum QC. If a virus is dropped for many sera, that may indicate some issue with that virus in assays:

In [10]:
virus_n_drops = groups_sera_qc_drops_df.groupby(
    ["group", "virus", "reason"], as_index=False
).aggregate(n_sera=pd.NamedAgg("serum", "nunique"))
assert virus_n_drops["n_sera"].sum() == len(groups_sera_qc_drops_df)

virus_n_drops_chart = (
    alt.Chart(virus_n_drops)
    .encode(
        alt.X("n_sera", title="number of sera for which virus is dropped"),
        alt.Y("virus", sort=alt.SortField("n_sera", order="descending")),
        alt.Row("group"),
        alt.Color("reason", title="reason dropped", legend=alt.Legend(labelLimit=350)),
        tooltip=virus_n_drops.columns.tolist(),
    )
    .mark_bar(height={"band": 0.8})
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virus_n_drops_chart
Out[10]:
In [ ]: